Quelle Nummer 120
Rubrik 22 : BIOLOGIE Unterrubrik 22.00 : BIOLOGIE
MIKROBIOLOGIE
KLAUS APEL
KERNDETERMINIERTE SYNTHESE VON "UNLOESLICHEN"
CHLOROPLASTENPROTEINEN IN ACETABULARIA, DISSERTTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DES FACHBEREICHS BIO-
LOGIE DER UNIVERSITAET HAMBURG, VORGELEGT VON KLAUS
APEL AUS SCHWERIN
HAMBURG 1970, S. 45-53
001 DISKUSSION. Bisherige Untersuchungen über die
002 Autonomie der Proteinsynthese in Chloroplasten waren zum größten
003 Teil in ihrer Aussagekraft begrenzt. Bei der vorliegenden Arbeit
004 ließen sich die Schwierigkeiten durch die Wahl des
005 Untersuchungsobjektes und durch die benutzten Untersuchungsmethoden
006 weitgehend überwinden. Im einzelnen müssen folgende Punkte
007 hervorgehoben werden: Chloroplasten wurden durch schonendes
008 Zentrifugieren gewonnen. Eine mechanische Schädigung der
009 Chloroplasten kann unter diesen Bedingungen weitgehend
010 ausgeschlossen werden. Verunreinigungen mit Bakterien ließen
011 sich durch das Auszentrifugieren des Zellplasmas so einschränken,
012 daß sie die Ergebnisse von Inkorporationsexperimenten nicht
013 beeinflussen. Verunreinigungen durch Kerne oder Kernfragmente
014 konnten durch Abschneiden des Rhizoids mit absoluter Sicherheit
015 ausgeschlossen werden. Aus Chloroplasten wurde eine schwer
016 lösliche Proteinfraktion isoliert. Damit konnte die Lösung des
017 Problems der Lokalisierung erleichtert werden, das sich vor allem
018 bei Arbeiten mit löslichen Proteinen als schwierig erwiesen hat.
019 Plasmareste, die nach dem Auszentrifugieren noch an der
020 Oberfläche der Chloroplasten anheften können, sollten durch das
021 wiederholte Waschen und Schütteln der Chloroplastenfraktion sowie
022 durch die Detergentienbehandlung mit Triton-X-100
023 vollständig abgelöst werden. Mitochondrien werden durch die
024 gleiche Behandlung und unter den benutzten
025 Zentrifugationsbedingungen von der Chloroplastenfraktion abgetrennt.
026 Es wurde eine Methode für die Isolierung gefunden, durch
027 die Schwankungen in der Zusammensetzung der
028 Chloroplastenproteinfraktion einer Art vermieden wurden. Damit
029 wird ein Vergleich zwischen verschiedenen Arten möglich. Der
030 Kerneinfluß konnte in Acetabularia durch hetorologe
031 Kerntransplantationsversuche bzw.
032 Kernimplantationsversuche direkt nachgewiesen werden. Die
033 Proteine der Chloroplasten lassen sich in wasserlösliche und in
034 wasserlösliche einteilen. Die hier untersuchten " unlöslichen "
035 Chloroplastenproteine dürften am Aufbau von
036 Chloroplastenmembranen beteiligt sein (Bailey et al., 1966)
037 und können somit als Membranproteine bezeichnet werden. Ein
038 besonderes Problem bei der Isolierung der Chloroplastenproteine
039 stellt die Tatsache dar, daß mit dem Zellplasma der Vakuolensaft
040 auszentriefugiert wird. Dabei schwankt der pH-Wert bei
041 verschiedenen Kulturen zwischen 3,4 und 4,0. Darüber
042 hinaus ist mit den Schwankungen des pH-Wertes wahrscheinlich
043 auch eine Veränderung in der Ionenzusammensetzung verbunden.
044 Beide Parameter beeinflussen die Löslichkeit der Proteine. Um
045 Veränderungen in der Zusammensetzung der Membranproteine zu
046 vermeiden, sind deshalb besondere Vorkehrungen zu treffen, damit
047 die Bedingungen konstant gehalten werden. Dazu wurde der pH-
048 Wert des Citrat-Phosphat-Puffers so eingestellt, daß er
049 nicht wesentlich vom durchschnittlichen pH-Wert der Cytoplasma
050 -Vakuolensaft-Mischung abweicht. Die Pufferkapazität in
051 diesem Bereich ist groß genug, um pH-Schwankungen des
052 Pflanzeninhalts auszugleichen. Mögliche Veränderungen in der
053 Ionenzusammensetzung können durch einen vierzigfachen Überschuß
054 an Citrat-Phosphat-Puffer hoher Konzentration (3,2
055 M) ausgeglichen werden. Eine wichtige Voraussetzung für die
056 Bearbeitung des umrissenen Problems war die Tatsache, daß
057 Unterschiede zwischen zwei Species von Acetabularia
058 gefunden werden konnten. Im Auftrennungsmuster der gelösten
059 Membranproteine aus A. mediterranea und A.
060 calyculus liegen neben einer Anzahl identischer Banden auch
061 mehrere Proteine vor, die als artspezifisch angesehen werden
062 müssen. Biedermann und Drews (1968) lösten die
063 Thylakoidproteine von Purpurbakterien und fanden nach
064 elektrophoretischer Auftrennung für jede der untersuchten Arten
065 ein artspezifisches Proteinmuster, Mani und Zalik (1970)
066 trennten eine Proteinfraktion aus Chloroplastenmembranen von
067 Phaseolus und Triticum elektrophoretisch auf und wiesen
068 ebenfalls artspezifische Muster nach. Abweichend von diesen
069 Befunden fanden Braunitzer und Bauer-Stäbe (1969) beim
070 Vergleich der Chloroplastenmembranproteine aus einer Monokotylen,
071 einer Dikotylen und einer Grünalge keine wesentlichen
072 Unterschiede. Nur das Proteinmuster einer Blaualge ist anders
073 aufgebaut. Man muß allerdings hinzufügen, daß die Auftrennung
074 unter diesen Bedingungen nur 3 Komponenten erkennen ließ,
075 während in den hier beschriebenen Experimenten mindestens 12
076 Banden getrennt wurden. Es wurde angenommen, daß bei allen
077 Pflanzen mit Ausnahme der Schizophyta die chemische Struktur des
078 Photosyntheseapparates grundsätzlich gleich ist. Durch den
079 Nachweis artspezifischer Chloroplastenproteine in Acetabularia
080 war es möglich, mit Hilfe heterologer Kerntransplantionen bzw.
081 Implatationen den Einfluß der Kern-DNS und der
082 Cloroplasten-DNS auf die Bildung dieser Proteine zu
083 überprüfen. In einer Reihe von Transplantationsversuchen wurden
084 Rhizoide von A. mediterranea auf kernlose Hinterstücke
085 von A. calyculus und umgekehrt Rhizoide von A.
086 calyculus auf kernlose A. mediterranea-
087 Hinterstücke übertragen. Nach 6 Wochen hatte sich in den
088 Transplantaten das Muster der Chloroplastenproteine in der Weise
089 verändert, daß sie dann der Art des Zellkernes entsprachen.
090 Die Chloroplastenproteine folgten damit, soweit es auf Grund der
091 Artspezifität geprüft werden konnte, jenen Gesetzen, die
092 Hämmerling bereits 1935 für die morphogenetischen Fähigkeiten
093 von Acetabularia-Zellen beschrieben hatte und wie sie
094 auf dem molekularen Niveau für die löslichen Chloropastenproteine
095 Malatdehydrogenase und Lactatdehydrogenase gefunden worden waren
096 (Reuter und Schweiger, 1969; Schweiger et al., 1967). Es
097 kann als gesichert angenommen werden, daß die Veränderung im
098 Muster der unlöslichen Chloroplastenproteine sowohl in den
099 Transplantationsexperimenten als auch in den
100 Implantationsexperimenten auf den Zellkern zurückzuführen sind.
101 Im einzelnen spricht folgendes dafür: Da während der
102 Isolierung der Chloroplastenproteine Schwankungen in der
103 Zusammensetzung des Mediums ausgeschlossen sind, kann die
104 Änderung im Proteinmuster nicht auf eine Veränderung z.B.
105 der Proteinlöslichkeit zurückgeführt werden. Gegen den
106 Einfluß äußerer Fraktoren spricht ebenfalls, daß die
107 Zusammensetzung der Membranproteine in verschiedenen Proben einer
108 Transplantat-Kombination gleich ist. Da neben dem
109 Zellkern auch andere Komponenten mit dem Rhizoidtransplantiert
110 werden, könnte man einwenden, daß die beobachtete Verändrung
111 der Chloroplastenproteine möglicherweise durch diese Anteile
112 hervorgerufen wird. In einer Reihe von Implantationsexperimenten,
113 in denen nicht das Rhizoid, sondern nur der weitgehend gereinigte
114 Kern übertragen wurde, wird dieses Argument ausgeschlossen. Die
115 Auftragsmuster der (Formel)-Implantate und der (Formel)-
116 Implantate gleichen jenen der entsprechenden Transplantate.
117 Der Einfluß des Kernes wird durch folgende Beobachtung eindeutig
118 nachgewiesen: Das in den Transplantaten nach 6 Wochen
119 auftretende Muster enspricht vollkommen jenem der Art, von der das
120 Rhizoid stammt. So geht z. B. im (Formel)-Transplantat das
121 ursprüngliche A. mediterranea-Muster der
122 Chloroplastenproteine in voraussagbarer Weise nach ungefähr 6
123 Wochen in ein A. calyculus-Muster über. Im
124 Proteinmuster der Transplantate sind nach 6 Wochen alle
125 ursprünglichen, artspezifischen Proteine durch solche ersetzt
126 worden, die vom eingepflanzten Kern kodiert werden. Mit dieser
127 Beobachtung stimmen andere experimentelle Ergebnisse überein, die
128 zeigen, daß nach einer solchen Zeitspanne zu mindest der
129 überwiegende Teil der Chloroplasten und damit auch der
130 Chloroplasten-Proteine in der Zelle neu gebildet werden. So
131 befinden sich in kernhaltigen Hinterstücke von A.
132 mediterranea (11 mm Stiellänge) ungefähr (Formel) Chloroplasten.
133 Nach 28 Tagen ist das Hinterstück auf die dreifache Länge
134 gewachsen. Gleichzeitig mit diesem Längenwachszum hat sich die
135 Anzahl der Chloroplasten ungefähr um das Vierfache auf (Formel)
136 vermehrt (Clauss et al., 1970; ähnliche Resultate bei
137 Shephard, 1965). Mit der Vermehrung der Chloroplasten nimmt
138 auch die Menge der Chloroplastenproteine stark zu. In
139 kernhaltigen Zellen, die innerhalb von 28 Tagen von 18 mm auf 34
140 mm ausgewachsen sind, steigt die Menge der Chloroplastenproteine
141 pro Zelle von 8 *ymr g Protein um das Fünfache auf 41 *ymr g an
142 (Clauss, 1958). Überträgt man diese Beobachtungen auf die
143 Transplantate, so zeigt sich, daß in den ausgewachsenen
144 Transplantaten nach 6 Wochen die überwiegende Mehrheit der
145 Membranproteine in Chloroplasten vom eingepflanzten, heterologen
146 Kern determiniert worden sein muß. Als mögliches Argument gegen
147 diese Deutung könnte der Hinweis gelten, daß neben dem
148 eingepflanzten Kern ein Teil der Proteinsynthese auch weiterhin
149 durch die vom ursprünlichen Kern stammende m-RNS gesteuert
150 werden könnte. Während jedoch in Zellstücken auch nach der
151 Kernentfernung die Synthese kernabhängiger Proteine über die
152 stabilen m-RNS-Moleküle weiterläuft, konnte gezeigt
153 werden, daß unter dem Einfluß des eingepflanzten, heterologen
154 Kernes die bereits vorhandenen m-RNS-Moleküle im
155 Transplantat abgebaut werden (Reuter und Schweiger, 1969;
156 Schweiger et al., 1967). Man muß davon ausgehen, daß unter
157 der Steuerung des Kernes neben der Neubildung von
158 Zellbestandteilen auch die am Aufbau der schon vorhandenen
159 Strukturen beteiligten Moleküle mit einem bestimmten turnover
160 gegen neu synthetisierte Komponenten ausgetauscht werden. Aus der
161 Einbauhöhe radioaktiv markierter Arminosauren läßt sich grob die
162 Anzahl aller neu gebildeten Proteine abschätzen. Nach
163 einstündiger Inkubation mit (Formel)-Leucin (Spez. Akt.:
164 6,6 mC pro mM) beträgt die eingebaute Radioaktivität in
165 der Chloroplastenproteinfraktion aus 10 A. mediterranea
166 -Zellen ungefähr 2,4 Zerfälle pro Sekunde. Für einen
167 Zeitraum von 6 Wochen bedeutet dies eine Aktivität von 2400
168 Zerfällen pro Sekunde, die 0,07 *rym C (Formel)-Leucin bzw.
169 ungefähr 0,0669 mg Leucin entspricht. Dieser Wert liegt
170 mit Sicherheit unter der tatsächlich eingebauten Leucinmenge, da
171 außer dem angebotenen (Formel)-Leucin erstens in der Zelle (Formel)-
172 Leucin im intrazellulären Aminosäurepool vorliegt, zweitens
173 durch Proteindegradation laufend neue (Formel)-Leucinmoleküle
174 freigesetzt werden und drittens die (Formel)-Leucinmenge durch
175 Neusynthese erhöht wird. Die Aminosäurezusammensetzung der hier
176 untersuchten " unlöslichen " Chloroplastenproteinfraktion ist
177 nicht bekannt. Eine ähnliche unlösliche Fraktion lamellarer
178 Strukturproteine aus Chloroplasten von Acetabularia
179 enthält 10 % Leucin (Goffeau, 1969). Mit diesem Wert
180 läßt sich grob die Menge der Proteine, die während einer Zeit
181 von 6 Wochen in 10 A. mediterranea-Zellen neu
182 synthetisiert werden, auf 669 *rym g schätzen. Die
183 Chloroplastenproteinfraktion aus 10 A. meditarranea-
184 Zellen enthält 81 *rym g Protein (12,5 *rym g Stickstoff;
185 Umrechnungsfaktor (math.Op.) 6,25; siehe auch Tabelle 1).
186 Innerhalb von 6 Wochen wird demnach ungefähr die achtfache Menge
187 an Chloroplastenproteinen synthetisiert. Neben einer Neusynthese
188 wird wahrscheinlich ein Teil der Proteine in den schon vor der
189 Transplantation ausgebildeten Chloroplasten Membranproteine
190 ersetzen. Nach 6 Wochen sind in den Transplantaten mehr als 80
191 % der vorhandenen Proteine unter dem Einfluß des
192 eingepflanzten, heterologen Kernes neu gebildet worden. Der
193 tatsächliche Wert muß nach den oben angeführten Überlegungen
194 noch höher liegen, so das die Menge der vor der
195 Kerntransplantation gebildeten Proteine mit Sicherheit zu gering
196 ist, um noch im Auftrennungsmuster nachgewiesen werden zu können.
197 In den Chloroplasten treten zwar alle Komponenten auf, die für
198 die Ausbildung von Merkmalen notwendig sind (Schweiger, 1969);
199 darüber hinaus ist auch der Einbau von Aminosäuren (Goffeau
200 und Brachet, 1965; Goffeau, 1969), DNS-Vorstufen
201 (Berger, 1967; Schweiger und Berger, 1964) und DNS
202 -Vorstufen (Berger und Schweiger, 1969) in Chloroplasten
203 beobachtet worden; andererseits wurde an Acetabularia
204 schon früher gezeigt, daß die Autonomie der Chloroplasten durch
205 den Einfluß des Kernes begrenzt ist. So wurde für die beiden
206 Chloroplastenenzyme Malatdehydrogenase und Lactatdehydrogenase die
207 Kernabhängigkeit experimentell nachgewiesen (Reuter und
208 Schweiger, 1969; Schweiger et al., 1967). Auch die
209 Tatsache, daß der circadiane Rhythmus der
210 Photosyntheseaktivität vom Kern kontrolliert werden kann, weist
211 auf die Grenzen der Autonomie der Chloroplasten hin (Schweiger
212 et al., 1964). Aus der Menge an DNS in einem
213 Chloroplasten konnte ferner abgeleitet werden, daß höchstens ein
214 Teil der Chloroplastenproteine von dieser DNS kodiert werden
215 kann. Es mußte deshalb angenommen werden, daß neben der
216 Malatdehydrogenase und der Lactatdehydrogenase die Synthese
217 weiterer Chloroplastenenzyme ebenfalls vom Zellkern gesteuert wird
218 (Schweiger, 1969). Es ist in gewisser Weise überraschend,
219 daß, wie in dieser Arbeit nachgewiesen wird, neben löslichen
220 auch unlösliche Proteine der Chloroplasten kernabhängig sind.
221 Gerade von den unlöslichen Proteinen, die maßgeblich am Aufbau
222 der Membransysteme der Chloroplasten beteiligt sind, sollte man am
223 ehestens annehmen, daß sie oranellenspezifische, also essentielle
224 Bestandteile der Chloroplasten darstellen. Diese Annahme führt
225 zu der Vermutung, daß die Synthese der an dem Aufbau der
226 organellenspezifischen Membransysteme beteiligten Proteine unter
227 der Kontrolle des Plastoms stehen sollte. Das hier vorgelegte
228 Ergebnis zeigt jedoch, daß der Chloroplast als integrierter
229 Bestandteil der Zelle so weit unter der Kontrolle des Zellkernes
230 steht, daß neben der Synthese löslicher Enzyme auch die Bildung
231 chloroplastenspezifischer Strukturkomponenten durch die Kern-
232 DNS kodiert wird. Im Hinblick auf die Evolution muß man also
233 annehmen, daß während der Herausbildung der einzelnen
234 Acetabularia-Arten der Chloroplast schon als
235 Zellbestandteil integriert gewesen ist. Die durch Veränderung an
236 der Kern-DNS ausgelöste Entwicklung artspezifischer
237 Merkmale schloß deshalb auch die der Chloroplasten mit ein. Die
238 Kernabhängigkeit ließ sich nur für die artspezifischen Proteine
239 in der Membranfraktion nachweisen, also für jene, für die
240 Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Arten gefunden wurden.
241 Dieses Ergebnis schließt nicht aus, daß die Synthese der
242 übrigen oder eines Teiles der übrigen Membranproteine durch die
243 Chloroplasten-DNS gesteuert werden kann. Indirekte
244 Hinweise auf eine solche Kodierung einzelner Membranproteine durch
245 das Erbmaterial der Chloroplasten lieferten Versuche mit
246 Chloramphenicol und Cycloheximid. Andere Ergebnisse weisen
247 darauf hin, daß Chloramphenicol selektiv die Synthese von
248 Proteinen an den Organellen-Ribosomen hemmt. In
249 Chloroplasten konnte eine hemmende Wirkung des Chloramphenicols
250 auf die Synthese mehrerer Enzyme wahrscheinlich gemacht werden.
251 Dazu gehören die Ribulosediphosphat-Carboxylase (Feierabend,
252 1966; Margulies, 1964; Smilie et al., 1967), die
253 Transketolase (Feierabend, 1966) und die Glycerinaldehyd-3
254 -phosphat-Dehydrogenase (Ziegler und Ziegler, 1966;
255 Smillie et al., 1967). Da die Synthese zweier dieser Enzyme
256 nur durch Chloramphenicol, nicht aber durch Cycloheximid gehemmt
257 wird, ist geschlossen worden, daß dieser Syntheseweg nicht über
258 80s-Ribosomen abläuft, also nicht kernabhängig ist (Smillie
259 et al., 1967). Es ist also in Betracht zu ziehen, daß
260 Enzyme durch die Chloroplasten-DNS determiniert werden,
261 wenngleich das auch bislang nicht direkt bewiesen werden konnte, da
262 Chloramphenicol nicht an der DNS, sondern erst am Chloroplasten
263 -Ribosom wirksam wird. Zu ähnlichen Ergebnissen führten auch
264 die hier beschriebenen Experimente an Acetabularia.
265 Allerdings wird in den Chloramphenicol-empfindlichen peaks der
266 Einbau auch dann gehemmt, wenn mit Cycloheximid nur die Synthese
267 an den 80s-Ribosomen blockiert wird. Es besteht einmal die
268 Möglichkeit, daß in Acetabularia die beiden
269 Synthesewege so miteinander verflochten sind, daß die Blockierung
270 eines Syntheseweges auch den anderen beeinflußt. Andererseits
271 könnten in den einzelnen peaks zusammengefaßt auch mehrere
272 verschiedene Proteine liegen, von denen einige an Chloroplasten
273 -Ribosomen gebildet werden. Hier würden beide Hemmstoffe
274 jeweils eine direkte Hemmung auf einzelne der in den peaks liegenden
275 Proteine ausüben. Diese Deutung steht nicht im Widerspruch zu
276 den oben genannten Ergebnissen, nach denen die Wirkung der
277 Hemmstoffe streng selektiv ist (Smillie et al., 1967).
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